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這篇文章主要介紹stringTie工具有什么用，文中介紹的非常詳細，具有一定的參考價值，感興趣的小伙伴們一定要看完！
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對于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)而言，最基礎的分析就是基因和轉(zhuǎn)錄本水平的定量了，定量就是確定一個基因或者轉(zhuǎn)錄本的表達量，其中定量的方式有很多種。
最直接的方式就是統(tǒng)計mapping到這個基因/轉(zhuǎn)錄本上的reads的個數(shù)，將reads數(shù)作為表達量。我們稱這種表達量為raw count。
在raw count的基礎上，利用外顯子長度進行歸一化，就得到了TPM值的定量方式。對于每個基因，將raw count除了該基因的長度（exon長度之和) , 得到長度歸一化之后的表達量。某個基因的TPM值就是利用歸一化之后的表達量，計算了一個相對豐度。具體計算公式如下，注意基因長度以k為單位
在raw count的基礎上，利用測序量和外顯子長度兩個因素進行歸一化，就得到了RPKM/FPKM值的定量方式。首先將raw count除了mapping 上的所有reads數(shù)，得到相對豐度，在除以該基因長度（exon長度之和）, 就可以計算出RPKM值。測試時每一條插入片段稱為一個fragment, 對于雙端測序，一個fragment 會得到兩條reads。
RPKM和FPKM 唯一不同的地方在于raw count的計算，RPKM 計算的是reads 數(shù)，而FPKM 值計算的是fragments 數(shù)，對于單端測序， fragment 和 reads 的個數(shù)是相等的；對于雙端測序，reads 數(shù)目是fragments 數(shù)目的兩倍，對于FPKM 而言，即使雙端的兩條reads都比對上了基因組，在計數(shù)時也知計一次，因為兩條reads來源于同一個fragment。
具體計算公式如下, 需要注意單位，mapping上的reads 總數(shù)以M為單位，基因長度以k為單位。
能夠進行定量的軟件有很多，本文主要介紹stringTie這款軟件。
在早期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中，最經(jīng)典的分析策略是tophat+cufflinks+cuffdiff, 這套分析的pipeline會給出基于FPKM值的定量結(jié)果，然后進行差異分析,但是隨著測序數(shù)據(jù)量的提高和分析手段的發(fā)展，這套分析策略出現(xiàn)了很多的問題。
首先就是tophat的速度很慢，相比新出的比對軟件，其速度可以算得上是龜速了，同樣的數(shù)據(jù)量，hisat/star只需要半個小時就可以比對完成，tophat2至少需要5到6個小時；其次，基于FPKM值得到的差異結(jié)果和實驗手段如qPCR驗證的一致性較差。
為了順應測序和分析的新趨勢，原本的開發(fā)團隊對整個pipeline進行了全面升級, 用hisat 代替tophat, 用stringTie + ballgown 代替cufflinks + cuffdiff。
stringTie 可以看做是cufflinks 軟件的升級版本，其功能和cufflinks是一樣的 ，包括下面兩個主要功能
轉(zhuǎn)錄本組裝
定量
相比cuffinks, 其運行速度更快。該軟件的官網(wǎng)如下
https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml
stringTie的輸入文件為經(jīng)過排序之后的bam文件，常見用法有以下幾種
1. 對已知轉(zhuǎn)錄本進行定量
對于模式生物，如human, mouse等，通常只需要對已知的轉(zhuǎn)錄本定量即可，用法如下
stringtie -p 10 \ -G hg19.gtf \ -o output.gtf \ -b ballgown_out_dir -e \ align.sorted.bam
-G參數(shù)指定參考基因組的gtf文件，-o指定輸出的文件，格式也為gtf, -b指定ballgown的輸出結(jié)果目錄，這個參數(shù)是為了方便下游進行ballgown差異分析，-e參數(shù)要求軟件只輸出已知轉(zhuǎn)錄本的定量結(jié)果。
在輸出的GTF格式的文件中，對于每個轉(zhuǎn)錄本，會給出以下3種表達量
coverage
TPM
FPKM
2. 組裝本組裝
對于單個樣本進行組裝，用法如下
stringtie align.sorted.bam -o assembly.gtf -p 20 -G hg19.gtf
在組裝的轉(zhuǎn)錄本中，也會給出定量的結(jié)果，對于組裝的新轉(zhuǎn)錄本和基因，默認采用STRG加數(shù)字編號進行區(qū)分，示例如下
gene_id "STRG.1" transcript_id "STRG.1.1"
單個樣本組裝完成后，會合并所有樣本的轉(zhuǎn)錄本組裝結(jié)果，得到一個非冗余的轉(zhuǎn)錄本集合，用法如下
stringtie --merge \ -o assembly.gtf \ -p 20 \ -G hg19.gtf \ sampleA.gtf sampleB.gtf
在合并的非冗余轉(zhuǎn)錄本中，采用MSTRG加數(shù)字編號對基因和轉(zhuǎn)錄本進行編號，示例如下
gene_id "MSTRG.2" transcript_id "MSTRG.2.2"
本質(zhì)上，stringTie只提供了轉(zhuǎn)錄本水平的表達量，定量方式包括TPM和FPKM值兩種。為了進行raw count的定量方式，官方提供了prepED.py腳本，可以計算出raw count的表達量，用法如下
python prepDE.py \ -i sample_list.txt \ -g gene_count_matrix.csv \ -o transcript_count_matrix.csv
輸入文件為sample_list.txt， 該文件為\t分隔的兩列，第一列為樣本名稱，第二列為定量的gtf文件的路徑，示例如下
sampleA A.stringtie.gtf sampleB B.stringtie.gtf
同時輸出基因和轉(zhuǎn)錄本水平的raw count表達量值。
采用stringTie進行定量，運行速度快是一個優(yōu)勢，同時提供raw count, FPKM, TPM 3種定量方式的結(jié)果，也是其最便利的地方。
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